Leitfaden - Immunologische Laboruntersuchung bei Tumorpatienten

Der Erfolg einer „immunstimulierenden“ Therapie bei Patienten mit Tumorerkrankungen hängt im Wesentlichen von folgenden Punkten ab: 

Ist die Immunstimulation indiziert?

  1. Die Immunstimulation muss indiziert sein, das heißt, es muss nachgewiesen sein, dass die funktionellen Immunparameter tatsächlich erniedrigt sind. Die Stimulation eines funktionell intakten Immunsystems ist nur in Ausnahmefällen hilfreich. Die aktuelle Immunkompetenz kann nur über funktionelle Untersuchungen (LTT-Immunfunktion, NK-Zell-Zytotoxizitätstest) erfolgen und auch nur damit ist der Erfolg im Nachhinein kontrollierbar.
  2. Es muss ausgeschlossen sein, dass nicht eine schon vorher bestehende Immunaktivierung Ursache einer reduzierten Lymphozyten- oder NK-Zellfunktion ist. Im zellulären Immunprofil sollten daher die HLADR+ T-Zellen nicht wesentlich erhöht und die CD4/CD8-Ratio nicht kleiner als 0,8 sein.
  3. Es muss nachgewiesen sein, dass der Patient über ausreichend stimulierbare Immunzellen (v.a. CD4+ Helferzellen) verfügt. Als Grenze werden 250 CD4+Zellen/µl angegeben. Anderenfalls ist eine immunrestaurative Therapie den immunstimulierenden Maßnahmen vorzuziehen (Spurenelemente, Vitamine, Thymus).

Bewegt sich das Immunsystem unter Therapie in die richtige Richtung?

Unter immunstimulierender Therapie (z.B. mit Mistel-, Organ- oder Mikroorganismen-haltige Präparaten), können folgende Laborparameter zur Verlaufsbeurteilung und Prognoseabschätzung herangezogen werden, die spezifische Fragen beantworten: 

Ist eine TH1-Polarisation erreicht worden?

Die Analyse erfolgt im TH1/TH2-Profil mit Messung von Interferon-gamma (IFNγ = TH1) und Interleukin-4 (IL4 = TH2) nach Stimulation der im Labor isolierten T-Lymphozyten des Patienten. Basale T-zelluläre Zytokinspiegel (im Blut) sind nicht aussagekräftig, da sie selbst bei schweren Dysbalancen in zu geringen Mengen ins Blut abgegeben werden. Ziel einer immunstimulierenden Therapie ist immer eine TH1-Polarisation (d.h. IFN-γ ↑, IL-4 ↓). IFN-γ bzw. die IFN-γ-produzierenden TH1-Zellen sind die wichtigsten Effektorzellen die zur Elimination „entarteter“ Zellen beitragen.

Abb. 1 Ungünstiges TH2-Übergewicht bei einem Patienten mit metastasierendem Rektum-Ca vor Therapie. Ziel einer immunstimulierenden Therapie ist ein Anstieg von IFN-γ bei Abfall von IL-4.

Bleibt der Anteil immunsuppressiver regulatorischer T-Zellen (Treg) niedrig?

Die regulatorischen T-Zellen (Treg) sind eine wichtige Untergruppe der CD4-Zellen (normal ca. 4-10%). Sie nehmen eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz ein, die bei Tumorerkrankungen kontraproduktiv ist. Regulatorische T-Zellen hemmen die Effektorfunktionen von zytotoxischen T-Zellen, NK-Zellen und anderen Immunzellen gegen Tumorantigene und unterstützen somit das Tumorwachstum. Es konnte eine direkte Korrelation zwischen der Anzahl der Treg-Zellen und dem Status des Tumors nachgewiesen werden. Fortgeschrittene Tumorstadien zeigten dabei eine zunehmende Infiltration des Gewebes mit Tregs. Zudem konnte ein inverser Zusammenhang zwischen der Anzahl der Tregs im Tumorgewebe und der Überlebensrate aufgezeigt werden.
Treg-Zellen eignen sich sehr gut als Verlaufsmarker bei  immunmodulierenden Therapien. Prognostisch günstig ist, wenn sie nicht ansteigen. Labordiagnostisch werden regulatorische T-Zellen zytofluorometrisch anhand der Markerkonstellation CD4+CD25++CD127low identifiziert.

Abb. 2  Das quantitative Immunprofil „Immunkompetenz Tumor“ wurde hier als Ausgangsstatus bei einer 58-jährigen Patientin mit Mamma-Ca erstellt. Trotz erniedrigter Zahl an CD4-Helferzellen zeigte sich mit 88% eine prognostisch günstige intakte CD31-Thymusreserve sowie eine erfreulich niedrige Treg-Zahl. Der Anteil an CD8+/CD28+ zytotoxischen T-Zellen ist (vor Therapie) zu gering. Aktivierte T- oder NK-Zellen sind nicht nachweisbar. Insgesamt besteht keine Kontraindikation für eine immunstimulierende Therapiemaßnahme. Der Befund wird immer numerisch und graphisch zur Verfügung gestellt.

Additiv zu diesem Nachweis wird auf Treg-Zellen das Oberflächenmolekül CD39 nachgewiesen. CD39 ist ein membranständiges Protein (Ektoenzym), welches die Umwandlung von ATP bzw. ADP in AMP bewirkt. Das AMP wird extrazellulär in Adenosin umgewandelt, welches immunsuppressiv wirkt. Der Nachweis der CD39+ Treg-Fraktion kann somit einen Hinweis geben über die aktuelle immunsuppressorische Kapazität der Treg-Zellen.

Steigen die CD8-Zellen mit zytotoxischer Effektorkapazität an?

Der häufig auch heute noch falsch verwendete Begriff CD8-Suppressorzellen für die gesamte CD8-Population ist überholt. Der „CD28-Status“ differenziert die CD8-Lymphozyten in Zellen mit zytotoxischen Eigenschaften und solche, die tatsächlich eine suppressorische (immunsuppressive) Funktion innehaben. Es ist verständlich, dass eine immunstimulierende Therapie zum Ziel hat, den Anteil an zytotoxischen, d.h. CD28-positiven CD8-Zellen zu erhöhen.

Nehmen die aktivierten Natürlichen Killerzellen zu?

Prognostisch günstig ist es, wenn unter immunstimulierender Therapie Aktivierungsmarker wie CD25 (Rezeptor für Interleukin-2) auf Natürlichen Killerzellen ansteigen. Allerdings ersetzt diese Untersuchung nicht die Analyse der NK-Zellfunktion.

Wie ist die Thymus-Restfunktion des Patienten?

Der Oberflächenmarker CD31 charakterisiert eine Subpopulation der naiven  CD4+-Helferzellen, die erst kürzlich den Thymus verlassen haben. Man spricht von „recent thymic emigrants – RTE-Zellen“. Der Anteil der CD31+ naiven CD4-Zellen im Blut ist somit ein Maß für die verbliebene Thymus-Restfunktion. Eine verminderte Thymusfunktion äußert sich in einer reduzierten „Nachschubfähigkeit“ an jungfräulichen T-Lymphozyten vor allem dann, wenn z.B. durch Infektionen oder nach Chemo- oder Strahlentherapie ein verstärkter „Verbrauch“ stattfindet. Die Untersuchung ist somit sinnvoll vor immunologisch belastenden Therapien zur Abschätzung der Regenerationsfähigkeit und evtl. Planung früher Intervention (Immunrestaurations-Marker).

Die genannten Parameter sind neben den bekannten Standardanalysen wie CD4, CD8, NK- und B-Zellen sowie aktivierten T-Zellen im quantitativen Immunprofil „Immunkompetenz Tumor“ enthalten.

Welches diagnostische Vorgehen ist zu empfehlen?

Vor immunstimulierender Therapie

  1. LTT-Immunfunktion + NK-Zellzytotoxizitätstest (zur Indikationsstellung und als Ausgangsbasis)
  2. Quantitatives Immunprofil „Immunkompetenz Tumor“
  3. TH1/TH2-Profil (als Ausgangswert)

Die Wiederholung der Analysen 6-8 Wochen nach Beginn der Immunstimulation beantwortet folgende Fragen:

  1. Hat sich die Funktion der T-Lymphozyten und der NK-Zellen verbessert?
  2. Zeigen     sich Verschiebungen bei den zellulären Markern, die für eine nachhaltige Verbesserung der immunologischen Situation sprechen (v.a. Treg-Zellen und Anteil an CD39+ Treg-Zellen, CD28+ zytotoxische T-Zellen)
  3. Konnte eine TH1-Polarisation erreicht werden (IFN-?-Anstieg und/oder IL4-Abfall?)

Anschließend sind in Abhängigkeit von der klinischen Situation Kontrollen im Abstand von 4-8 Monaten zu empfehlen, wobei man sich auf die im Ausgangsbefund pathologischen Befunde beschränken kann.

Erläuternde Darstellung eines sehr guten Verlaufsbefundes nach alternierender Therapie mit Mistel und einem Thymuspräparat bei einer 54-jährigen Patientin mit Mamma-Ca.

Vorbefund:                                                                                 Kontrollbefund 6 Wochen später:

1. LTT-Immunfunktion

Abb. 3  Der LTT-Immunfunktion erlaubt die Analyse der Funktion von Lymphozyten sowie indirekt auch der Monozyten und Dentritischen Zellen. Der Test beruht auf dem Prinzip der Lymphozytenstimulation durch Gedächtnisantigene (Recallantigene), gegen die bei intakter zellulärer Immunkompetenz eine starke Immunreaktivität bestehen sollte. Im Testansatz werden diese Antigene  durch Monozyten und dendritische Zellen aufbereitet und den T- Helferlymphozyten präsentiert. Diese werden in Korrelation zur aktuellen Immunfunktion aktiviert und zur Zellteilung angeregt. Die dabei obligate DNS-Synthese wird quantitativ erfasst.

2. NK-Zell-Zytotoxizitätstest und TH1/TH2-Profil

Abb. 4  Beim NK-Zell-Zytotoxizitätstest wird im Labor eine Tumorzelllinie mit dem Membranfarbstoff Calcein markiert. Anschließend werden unter standardisierten Bedingungen die NK-Zellen des Patienten zugesetzt. Bei dem durch die NK- Zellen induzierten Lyseprozess der Tumorzellen wird der Farbstoff Calcein freigesetzt und dann quantitativ bestimmt. Durch Paralleluntersuchung standardisierter Kontrollansätze kann somit der prozentuale Anteil an zerstörten Tumorzellen bestimmt werden.
Zur Untersuchung der TH1/TH2-Balance wird heparinisiertes Blut des Patienten für 24 h mit unspezifischen Stimulantien (Concanavalin A und SEB) versetzt. Anschließend werden die in den Überstand freigegebenen Zytokine mittels Multiplex-ELISA parallel aus einem Ansatz bestimmt.

3. Immunprofil „Immunkompetenz Tumor“

Abb. 5  Die Differenzierung der Immunzellen erfolgt an Hand der Bindung fluoreszenzmarkierter monoklonaler zellspezifischer Antikörper und anschließender Analyse mittels FACS-Scan. Die graphische Darstellung dient lediglich der besseren Erkennung von abweichenden Verteilungen.

Das Immunprofil „Immunkompetenz Tumor“ wurde entwickelt und evaluiert in Kooperation mit der Deutschen Gesellschaft für Onkologie (DGO).

Material

LTT-Immunfunktion: 20 ml Heparinblut + 5 ml Vollblut (Serum)
NK-Zell-Zytotoxizitätstest: 10 ml Heparinblut
Quantitatives Immunprofil „Immunkompetenz Tumor“: 2 ml EDTA-Blut
TH1/TH2-Profil: 5 ml Heparinblut
 

Literatur

  • AM Gallimore et al. Positive and negative influences of regulatory T cells on tumour immunity. Oncogene 2008; 27:5586-93
  • Kohler S, Thiel A. Life after the thymus - CD31+ and CD31- human naive CD4+ T-cell subsets. Blood. 2008; 26
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  • Kilpatrick RD, Rickabaugh T, Hultin LE, Hultin P, Hausner MA, Detels R, Phair J, Jamieson BD. Homeostasis of the naive CD4+ T cell compartment during aging. J Immunol. 2008 1;180:1499-507.
  • Sun X, Wu Y, Gao W, Enjyoji K, Csizmadia E, Müller CE, Murakami T, Robson SC.CD39/ENTPD1 expression by CD4+Foxp3+ regulatory T cells promotes hepatic metastatic tumor growth in mice.